Цикл Кребса. Циклический процесс окисления пировиноградной кислоты описал английский ученый Ханс Кребс. Если в клетку поступает кислород, то анаэробный процесс - гликолиз переходит в аэробный. В этом случае ПВК не восстанавливается до молочной кислоты, а переносится в митохондрии (см. § 9), где окисляется до производного уксусной кислоты. При этом одна молекула НАД + восстанавливается до НАД-Н, а один атом углерода окисляется до С0 2 (рис. 20). Таким образом, из трехуглеродной молекулы ПВК - С3Н403 образуется двухуглеродная молекула активированной уксусной кислоты. Уксусная кислота - это С 2 Н 4 0 2 , а ее сложно устроенное активированное производное, которое называют ацетилкоферментом А, или сокращенно ацетил-КоА (от лат. «ацетум» - уксус), можно в упрощенном виде выразить формулой С 2 Н 3 0-SKoA.

Рис. 20. Биологическое окисление с участием кислорода.
Слева - цикл Кребса; справа - цепь переноса электронов. ПВК - пиро-виноградная кислота; АК - ацетил-КоА; красные квадраты под номерами 1-8 - органические кислоты, переносящие в цикле Кребса остаток окисляемой уксусной кислоты; П 1 -П 4 - переносчики электронов в цепи

Ацетил-КоА, вступая в цикл Кребса, соединяется с органической кислотой (на рис. 20, - это 8), которая служит своего рода переносчиком остатка уксусной кислоты. Ацетил-КоА, соединяясь со своим переносчиком - 8, образует соединение 1, в составе которого начинается окисление остатка уксусной кислоты. Перемещаясь по ферментному конвейеру цикла Кребса (на рисунке 20 ферменты обозначены стрелками на кольце), остаток уксусной кислоты постепенно полностью окисляется. При этом образуются две молекулы С0 2 и, в результате восстановления НАД + , четыре молекулы НАД-Н, в которых запасена энергия высокоэнергетических электронов остатка уксусной кислоты. Структуры переносчиков (они также являются органическими кислотами) и самого остатка уксусной кислоты при прохождении по циклу Кребса меняются: из соединения 1 возникают соединения 2, 3, 4, 5, 6, 7 и, наконец, 8, которое готово снова присоединить остаток уксусной кислоты (АК). Таким образом, круг замыкается.

Самый важный результат процессов, происходящих в цикле Кребса, - образование богатых энергией молекул НАД-Н. На последнем этапе аэробного процесса, а именно в цепи переноса электронов, энергия молекул НАД-Н служит для синтеза универсального «аккумулятора» энергии - молекул АТФ.

Цепь переноса электронов. Окислительное фосфорилирование. На этом этапе высокоэнергетические электроны НАД-Н перемещаются по многоступенчатой цепи переносчиков, как по лестнице, идущей вниз. При переходе с высшей ступени на низшую электрон теряет энергию, которая используется для образования высокоэнергетической связи в АТФ.

Переносчик электронов на высшей ступени способен передать электрон более сильному акцептору электронов на низшей ступени. Переносчик-акцептор становится донором электрона, когда передает его еще более сильному акцептору. Самый сильный акцептор электрона - кислород, расположенный в конце цепи (рис. 20, справа).

При прохождении высокоэнергетического электрона НАД-Н по «ступенькам» этой цепи до кислорода за счет его энергии три молекулы АДФ фосфорилируются до трех молекул АТФ.

В результате присоединения к кислороду четырех электронов (е ~), пришедших из цепи переноса, и четырех протонов (Н +) из водной среды молекула кислорода восстанавливается до двух молекул воды: ===0 2 + 4е - + 4Н + → 2Н 2 0

Таким образом происходит полное окисление глюкозы до С0 2 (в цикле Кребса) и Н 2 0 (в цепи переноса электронов), так же как если бы глюкоза сгорала в пламени костра, где ее энергия ушла бы в тепло. Однако при биологическом окислении только часть химической энергии превращается в тепловую. За счет окисления одной молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ, которые используются в клетках и в организме во всех случаях, когда требуется энергия: для движения, транспорта веществ, синтеза нуклеиновых кислот, белков, углеводов и многого другого (в том числе и для умственной работы, на которую затрачивается много АТФ).

Фосфорилирование АДФ с образованием АТФ сопряжено с окислением и потреблением кислорода. Поэтому процесс этот называют окислительным фосфорилированием.

В клетках окислению подвергаются не только глюкоза, но и другие сахара, а также жиры и некоторые аминокислоты. В большинстве случаев в результате многочисленных ферментных превращений из этих соединений образуются ацетил-КоА или органические кислоты (на рис. 20, А, ПВК и 4), которые поступают в цикл Кребса.

Таким образом, окисление пировиноградной и некоторых других органических кислот ведет к образованию НАД-Н. Богатые энергией электроны НАД-Н поступают в цепь переноса и по пути к конечному акцептору - кислороду отдают свою энергию для синтеза АТФ. Цикл Кребса вместе с цепью переноса электронов выступает в роли энергетического «котла», в котором «сгорают» различные пищевые вещества: в цикле Кребса они передают свою энергию НАД-Н, а в цепи переноса электронов за счет окисления НАД-Н образуется АТФ.

Митохондрии - энергетические станции клетки. Очень кратко о митохондриях было рассказано в § 9. Напомним, что эти органоиды обнаруживаются во всех аэробных эукариотических (т. е. содержащих ядра) клетках: в одноклеточных и многоклеточных организмах животных и растений (как мы уже упоминали в § 11, в отсутствие освещения растения ведут себя как аэробные организмы). Внутренняя мембрана митохондрий образует многочисленные складки - кристы. Между кристами находится вязкая белоксодержащая масса - матрикс. В матриксе расположены все ферменты цикла Кребса, а на внутренней мембране - цепь переноса электронов. В различных типах клеток, на разных этапах развития в каждой клетке может содержаться от нескольких десятков до тысячи митохондрий. Митохондрии имеют собственный генетический аппарат, представленный кольцевыми молекулами ДНК.

Можно считать доказанным, что митохондрии более миллиарда лет тому назад были самостоятельными микроорганизмами. Эти аэробные прокариотические микроорганизмы внедрились в анаэробные эукариотические клетки, и в результате этого возник взаимовыгодный симбиоз. За многие миллионы лет часть бактериальных генов переместилась из митохондриальной в ядерную ДНК, и митохондрии стали зависимыми от клетки-хозяина (как и клетка-хозяин от митохондрий). Митохондриальные рибосомы, транспортные РНК (тРНК) и ряд ферментов митохондрий близки по структуре и свойствам к бактериальным и отличаются от сходных по функциям структур, которые содержатся в цитоплазме клетки-хозяина.

1. Какова роль ферментативного конвейера цикла Кребса?
2. В чем суть цикла Кребса?
3. Что такое окислительное фосфорилирование?
4. Каков энергетический эффект полного окисления глюкозы?

Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Кребсом. Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что цикл трикарбоновых кислот является "фокусом", в котором сходятся практически все метаболические пути.

Итак, образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата ацетил-КоА вступает в цикл Кребса. Данный цикл состоит из восьми последовательных реакций (рис. 91). Начинается цикл с конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом и образования лимонной кислоты. (Как будет видно ниже, в цикле окислению подвергается собственно не ацетил-КоА, а более сложное соединение - лимонная кислота (трикарбоновая кислота). )

Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода) и дскарбоксилирований (отщепление СО 2) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса появляется оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т. е. в результате полного оборота цикла молекула ацетил-КоА сгорает до СО 2 и Н 2 О, а молекула оксалоацетата регенерируется. Ниже приводятся все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса.

В первой реакции, катализируемой ферментом цитратсинтазой, ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом. В результате образуется лимонная кислота:

По-видимому, в данной реакции в качестве промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA.

Во второй реакции цикла образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту. Катализирует эти обратимые реакции гидратации-дегидратации фермент аконитат-гидратаза:

В третьей реакции, которая, по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса, изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы:

(В тканях существует два типа изоцитратдегидрогеназ: НАД- и НАДФ-зависимые. Установлено, что роль основного катализатора окисления изолимонной кислоты в цикле Кребса выполняет НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа. )

В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg 2+ или Мn 2+ .

В четвертой реакции происходит окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты до сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с реакцией окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА. α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в ходе реакции принимают участие пять коферментов: TДФ, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД и НАД. Суммарно данную реакцию можно написать так:

Пятая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой. В ходе этой реакции сукцинил-КоА при участии ГДФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат). Одновременно происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ1 за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА:

(Образовавшийся ГТФ отдает затем свою концевую фосфатную группу на АДФ, вследствие чего образуется АТФ. Образование высокоэргического нуклеозидтрифосфата в ходе сукцинил-КоА-синтетазной реакции - пример фосфорилирования на уровне субстрата. )

В шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту. Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой с белком ковалентно связан кофермент ФАД:

В седьмой реакции образовавшаяся фумаровая кислота гидратируется под влиянием фермента фумаратгидратазы. Продуктом данной реакции является яблочная кислота (малат). Следует отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью, - в ходе данной реакции образуется L-яблочная кислота:

Наконец, в восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы происходит окисление L-малата в оксалоацетат:

Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление ("сгорание") одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов (или в цепи дыхательных ферментов), локализованной в митохондриях.

Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ. Из четырех пар атомов водорода три пары переносятся через НАД на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуются три молекулы АТФ (в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего, следовательно, девять молекул АТФ. Одна пара атомов попадает в систему транспорта электронов через ФАД, - в результате образуются 2 молекулы АТФ. В ходе реакций цикла Кребса синтезируется также 1 молекула ГТФ, что равносильно 1 молекуле АТФ. Итак, при окислении ацетил-КоА в цикле Кребса образуется 12 молекул АТФ.

Как уже отмечалось, 1 молекула НАДН 2 (3 молекулы АТФ) образуется при окислительном декарбоксилирова-нии пирувата в ацетил-КоА. Так как при расщеплении одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пирувата, то при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих двух оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется 30 молекул АТФ (следовательно, окисление одной молекулы пирувата до СО 2 и Н 2 O дает 15 молекул АТФ).

К этому надо добавить 2 молекулы АТФ, образующиеся при аэробном гликолизе, и 4 молекулы АТФ, синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН 2 , которые образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в дегидрогеназной реакции. Итого получим, что при расщеплении в тканях 1 молекулы глюкозы по уравнению: C 6 H 12 0 6 + 60 2 -> 6СO 2 + 6Н 2 O синтезируется 36 молекул АТФ, что способствует накоплению в макроэргических фосфатных связях аденозинтрифосфата 36 X 34,5 ~ 1240 кДж (или, по другим данным, 36 Х 38 ~ 1430 кДж) свободной энергии. Другими словами, из всей освобождающейся при аэробном окислении глюкозы свободной энергии (окодо 2840 кДж) до 50% ее аккумулируется в митохондриях в форме, которая может быть использована для выполнения различных физиологических функций. Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным процессом, чем гликолиз. Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН 2 в дальнейшем при окислении дают не 6 молекул АТФ, а только 4. Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН 2 не способны проникать через мембрану внутрь митохондрий. Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого глицерофосфатного челночного механизма (рис. 92). Как видно на рисунке, цитоплазматический НАДН 2 сначала реагирует с цитоплазматическим дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализируется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой.

Цикл трикарбоновых кислот - он же цикл Кребса, поскольку существование такого цикла было предположено Гансом Кребсом в 1937 году.
За это спустя 16 лет он был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине. Значит, открытие весьма значительное. В чём же смысл этого цикла и почему он так важен?

Как ни крути, все равно придётся начать довольно-таки издалека. Если вы взялись читать эту статью, то хотя бы понаслышке знаете, что основной источник энергии для клеток - это глюкоза. Она постоянно присутствует в крови в практически неизменной концентрации - для этого существуют специальные механизмы, запасающие или высвобождающие глюкозу.

Внутри каждой клетки находятся митохондрии - отдельные органеллы ("органы" клетки), перерабатывающие глюкозу для получения внутриклеточного источника энергии - АТФ. АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) универсальна и очень удобна в использовании, как источник энергии: она напрямую встраивается в белки, обеспечивая их энергией. Самый простой пример - это белок миозин, благодаря которому мышцы способны сокращаться.

Глюкозу невозможно превратить в АТФ, несмотря на то, что в ней содержится большое количество энергии. Как извлечь эту энергию и направить в нужное русло, не прибегая к варварским (по клеточным меркам) средствам типа сжигания? Надо использовать обходные пути, благо ферменты (белковые катализаторы) позволяют некоторым реакциям протекать гораздо быстрее и эффективнее.

Первый этап - это превращение молекулы глюкозы в две молекулы пирувата (пировиноградной кислоты) или лактата (молочной кислоты). При этом выделяется небольшая часть (примерно 5%) той энергии, что запасена в молекуле глюкозы. Лактат получается при анаэробном окислении - то есть в отсутствие кислорода. Также есть способ превращения глюкозы в анаэробных условиях в две молекулы этанола и углекислый газ. Это называется брожением, и этот способ мы рассматривать не будем.


...Так же как не будем мы рассматривать подробно сам механизм гликолиза, то есть расщепления глюкозы в пируват. Поскольку, цитируя Леинджера, "Превращение глюкозы в пируват катализируется десятью ферментами, действующими последовательно". Желающие могут открыть учебник по биохимии и подробно ознакомиться со всеми стадиями процесса - он изучен очень хорошо.

Казалось бы, путь от пирувата до углекислого газа должен быть довольно простым. Но оказалось, что он осуществляется посредством девятистадийного процесса, который и называется циклом трикарбоновых кислот. Это кажущееся противоречие с принципом экономии (неужели нельзя было проще?) отчасти объясняется тем, что цикл связывает между собой несколько метаболических путей: вещества, образующиеся в цикле, являются прекурсорами других молекул, уже не имеющих отношения к дыханию (например, аминокислот), а любые другие соединения, подлежащие утилизации, в итоге попадают в цикл и либо "сгорают" для получения энергии, либо перерабатываются в те, которые находятся в недостатке.

Первая стадия, которая традиционно рассматривается в отношении к циклу Кребса - это окислительное декарбоксилирование пирувата в ацетильный остаток (Acetyl-CoA). CoA, если кто не знает - это кофермент А, имеющий в своём составе тиольную группу, на которой он может переносить ацетильный остаток.


Расщепление жиров тоже приводит к ацетилам, которые также вступают в цикл Кребса. (Синтезируются они аналогично - из Acetyl-CoA, что объясняет тот факт, что в жирах почти всегда присутствуют только кислоты с чётным числом атомов углерода).

Ацетил-КоА конденсируется с молекулой оксалоацетата, давая цитрат. При этом высвобождается кофермент А и молекула воды. Эта стадия необратима.

Цитрат дегидрируется в цис-аконитат - вторую трикарбоновую кислоту в цикле.

Цис-аконитат присоединяет обратно молекулу воды, превращаясь уже в изолимонную кислоту. Эта и предыдущая стадии обратимы. (Ферменты катализируют как прямую, так и обратную реакции - вы же знаете, да?)

Изолимонная кислота декарбоксилируется (необратимо) и одновременно окисляется, давая кетоглутаровую кислоту. При этом NAD+, восстанавливаясь, превращается в NADH.

Следующая стадия - окислительное декарбоксилирование. Но при этом образуется не сукцинат, а сукцинил-КоА, который на следующей стадии гидролизуется, направляя высвобождающуюся энергию на синтез АТФ.

При этом образуется ещё одна молекула NADH и молекула FADH2 (кофермент, отличный от NAD, который однако так же может окисляться и восстанавливаться, запасая и отдавая энергию).

Выходит, что оксалоацетат работает как катализатор - он не накапливается и не расходуется в процессе. Так и есть - концентрация оксалоацетата в митохондриях поддерживается довольно низкой. А как избежать накопления других продуктов, как согласовать между собой все восемь стадий цикла?

Для этого, как оказалось, существуют специальные механизмы - своего рода отрицительная обратная связь. Как только концентрация какого-то продукта растёт выше нормы, это блокирует работу фермента, ответственного за его синтез. А для обратимых реакций всё ещё проще: при превышении концентрации продукта реакция просто начинает идти в обратную сторону.

И ещё пара мелких замечаний

Процессы анаэробного брожения служили главным источником энергии для всего живого в те времена, когда в атмосфере Земли еще не было кислорода. Его появление открыло принципиально новые возможности получения энергии. Кислород – хороший окислитель, а при окислении органических веществ выделяется в десятки раз больше энергии, чем в ходе брожения. Так, в ходе реакции окисления глюкозы C 6 H 12 O 6 + 6О 2 → 6Н 2 О + 6CО 2 выделяется энергии 686 ккал на моль, тогда как при реакции молочнокислого брожения только 47 ккал на моль.

Естественно, клетки стали использовать открывшиеся возможности. Синтез АТФ в аэробных условиях значительно эффективнее анаэробных синтезов: если при утилизации 1 молекулы глюкозы в процессах брожения образуется 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования – около 30 (по старым данным – 38). Подробнее мы поговорим об энергетическом балансе на уроке 12.

Окислительным превращениям подвергаются различные органические вещества – промежуточные метаболиты обмена аминокислот, сахаров, жирных кислот и др. Было бы нелогично создавать для каждого из них свой собственный метаболический путь. Гораздо удобнее сначала окислять все эти вещества одним, унифицированным окислителем, а затем уже окислять образовавшуюся восстановленную форму такого «универсального окислителя» кислородом. В качестве этого универсального окислительно-восстановительного промежуточного соединения в клетке используется никотинамидадениндинуклеотид – НАД; мы уже говорили об этом соединении на уроке 10. Как указывалось в 10-м уроке, это вещество может существовать в двух формах: окисленной НАД + и восстановленной НАД∙Н. Для превращения первой формы во вторую необходимо поступление двух электронов и одного иона Н + .

Система играет роль окислительно-восстановительного челнока, переносящего электроны от различных органических веществ к кислороду: на первой стадии НАД + отнимает электроны у органических веществ, окисляя их в конце концов до CО 2 и Н 2 О (разумеется, не в одну стадию, а через многочисленные промежуточные соединения); на второй стадии кислород окисляет НАД∙Н, образовавшийся в ходе первой стадии, и возвращает его вновь в окисленное состояние.

Итак, в самом общем виде совокупность реакций распада различных веществ в аэробных условиях (то есть в присутствии кислорода) можно представить так:

1)	органические соединения +
2)

Реакции первого этапа идут или в цитоплазме, или в митохондриях, тогда как реакции второго этапа – только в митохондриях. На этом уроке мы рассмотрим лишь реакции первой группы, реакции второй группы будут изучаться на 12-м уроке.

В клетке имеется еще один кофермент – ФАД (флавинадениндинуклеотид) – который тоже служит окислительно-восстановительным челноком, но используется в меньшем числе реакций, чем НАД; он синтезируется из витамина В 2 – рибофлавина.

Давайте рассмотрим конкретные метаболические пути – окислительные превращения глюкозы и жирных кислот. Аэробный гликолиз начинается с тех же реакций, что и уже рассмотренный нами анаэробный гликолиз (см. урок 10). Однако конечные стадии процесса будут протекать по-другому. При проведения анаэробного гликолиза перед клеткой стояла проблема: куда девать восстановленный НАД∙Н, образующийся в ходе глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназной реакции? Если его не окислять обратно в НАД + , то процесс быстро остановится, поэтому в анаэробном гликолизе последняя реакция – лактатдегидрогеназная – как раз и служила для возвращения этого кофермента в исходную форму. В аэробных условиях такой проблемы нет. Наоборот, в кислородном метаболизме НАД∙Н служит ценнейшим источником энергии – специальная система переносчиков доставляет его из цитозоля в митохондрии, где он окисляется, и за счет этой энергии синтезируется АТФ.

Когда гликолиз протекает в аэробных условиях, пировиноградная кислота не будет восстанавливаться, а будет транспортироваться в митохондрию и окисляться. Сначала она превратится в остаток уксусной кислоты, ацетил, ковалентно присоединенный к особому коферменту – так называемому коэнзиму А.

Эту необратимую реакцию проводит митохондриальный фермент пируватдегидрогеназа, который окисляет пировиноградную кислоту до ацетил-коэнзима А с освобождением углекислоты. Этот фермент содержит несколько коферментов, необходимых для его работы: тиаминпирофосфат (образуется из витамина В 1 – тиамина), липоевую кислоту (она иногда применяется в качестве укрепляющей здоровье пищевой добавки) и ФАД (про него мы уже писали выше). Это очень сложный белок, состоящий из многих субъединиц, его молекулярная масса составляет несколько миллионов дальтон.

Коэнзим А, к которому присоединяется ацетильный остаток, синтезируется из пантотеновой кислоты, также являющейся витамином (витамин В 5). Ацетил-коэнзим А является макроэргом, столь же богатым энергией, сколь и АТФ (см. урок 9).

Пируватдегидрогеназа играет важную роль в регуляции аэробного катаболизма глюкозы. Этот фермент ингибируется НАД∙Н и ацетил-КоА – своими конечными продуктами - по принципу отрицательной обратной связи. Регуляция осуществляется с помощью сложного механизма, включающего и аллостерию, и ковалентную модификацию этого белка. Данный фермент также ингибируется жирными кислотами. Жирные кислоты – более калорийный источник энергии, и кроме того, они менее ценны для проведения синтетических процессов в клетке, поэтому при наличии и глюкозы (ведь пируват образуется из нее), и жирных кислот целесообразно сперва окислять жирные кислоты.

Затем ацетил-коэнзим А будет окисляться до CО 2 и Н 2 О в ходе процесса, называемого циклом Кребса (в честь Г. Кребса, впервые описавшего его в 1937 г.).

Основная роль цикла Кребса в энергетическом обмене клетки состоит в получении восстановленных коферментов НАД∙Н и ФАД∙Н 2 , которые затем будут окисляться кислородом для синтеза АТФ из АДФ и фосфата (этот процесс мы рассмотрим на уроке 12). Восстановление коферментов достигается за счет полного окисления остатка уксусной кислоты до CО 2 и Н 2 О.

Цикл начинается с переноса остатка уксусной кислоты из ацетил-КоА к щавелевоуксусной кислоте (в нейтральной среде это ион оксалоацетата), в результате чего образуется лимонная кислота (точнее, цитрат-ион), а коэнзим А освобождается. Эта реакция катализируется ферментом цитратсинтазой, она необратима.

Участвующие на этом этапе органические кислоты имеют три карбоксильные группы, иногда и весь цикл называют «циклом трикарбоновых кислот», но это название неудачное – уже на следующей стадии одна карбоксильная группа теряется. Поэтому часто цикл называют «циклом трикарбоновых и дикарбоновых кислот».

В обоих случаях выделяется углекислота, окислитель НАД + восстанавливается до НАД∙Н, а укороченный остаток кислоты в ходе реакции присоединяется к коэнзиму А. Только пировиноградная кислота давала двухуглеродный остаток (ацетил-КоА), а вот α-кетоглютаровая дает четырехуглеродный – сукцинил-коэнзим А. α-кетоглютаратдегидрогеназная реакция так же необратима, как и пируватдегидрогеназная, а катализирующий ее фермент содержит те же коферменты.

Продукт реакции сукцинил-коэнзим А, столь же богат энергией, как и ацетил-коэнзим А. Было бы глупо рассеивать эту энергию в тепло, и клетка не допускает такого расточительства. Сукцинил-КоА не просто гидролизуется до янтарной кислоты (точнее, сукцинат-иона) и коэнзима А, в ходе этой реакции происходит синтез ГТФ из ГДФ и фосфата, а ГТФ так же макроэргичен, как АТФ.

Янтарная кислота подвергается дальнейшему окислению. Однако ее окислителем служит не привычный нам НАД + , а другой кофермент – ФАД. Природа использовала именно этот кофермент вовсе не для того, чтобы отравить жизнь студентам и школьникам, изучающим цикл Кребса. Дело в том, что в янтарной кислоте окислению подвергается весьма инертная группа –СН 2 –СН 2 –. Вспомните курс органической химии – алканы в общем-то малореакционноспособны по сравнению со спиртами и альдегидами, окислить их гораздо труднее. Вот и здесь клетка вынуждена использовать более сильный флавиновый окислитель, а не обычный никотинамидный. Янтарная кислота при этом превращается в фумаровую, реакцию ускоряет фермент сукцинатдегидрогеназа.

Последней реакцией цикла является окисление яблочной кислоты до щавелевоуксусной, окислителем служит хорошо знакомый нам НАД + , катализирует реакцию фермент малатдегидрогеназа.

Образовавшиеся НАД∙Н и ФАД∙Н 2 затем окисляются в митохондриях, обеспечивая энергией синтез АТФ. В цикле Кребса образуется также 1 молекула ГТФ, богатого энергией соединения, способного передать фосфатный остаток на АДФ и образовать АТФ. Молекула щавелевоуксусной кислоты выходит из цикла без всяких изменений – она служит как бы катализатором окисления ацетил-коэнзима А, а сама возвращается в исходное состояние в конце каждого оборота цикла. Ферменты цикла Кребса расположены в матриксе митохондрий (кроме сукцинатдегидрогеназы, она находится на внутренней митохондриальной мембране).

В цикле Кребса подвергаются регуляции сразу несколько ферментов. Изоцитратдегидрогеназа ингибируется НАД∙Н – конечным продуктом цикла, и активируется АДФ – веществом, образующимся при энергетических затратах. Важную роль в регуляции цикла играет также обратимость малатдегидрогеназной реакции. При высоких концентрациях НАД∙Н эта реакция протекает справа налево, в сторону образования малата. В результате концентрация оксалоацетата падает, и скорость цитратсинтазной реакции снижается. Образовавшийся малат может использоваться в других метаболических процессах. Цитратсинтаза еще и аллостерически ингибируется АТФ. Регулируется и активность α-кетоглютаратдегидрогеназы.

Цикл Кребса участвует в окислительных превращениях не только глюкозы, но также жирных кислот и аминокислот. После проникновения через наружную мембрану жирные кислоты сперва активируются в цитоплазме путем присоединения коэнзима А, при этом затрачиваются две макроэргические связи АТФ:

R–COOH + HS–KoA + АТФ = R–CO–S–KoA + АМФ + Ф–Ф.

Пирофосфат тут же расщепляется ферментом пирофосфатазой, смещая равновесие реакции вправо.

Ацил-коэнзим А затем переносится в митохондрию.

В этих органеллах действует ферментативная система так называемого β-окисления жирных кислот. Процесс β-окисления протекает поэтапно. На каждом этапе от жирной кислоты отщепляется двухуглеродный фрагмент в виде ацетил-коэнзима А, а также происходит восстановление НАД + до НАД∙Н и ФАД до ФАД∙Н 2 .

В ходе первой реакции происходит окисление группы –СН 2 -СН 2 –, расположенной около карбонильного атома углерода. Как и при окислении сукцината в цикле Кребса, окислителем служит ФАД. Затем (вторая реакция) происходит гидратация двойной связи образовавшегося непредельного соединения, при этом третий атом углерода становится гидроксилированным – образуется β-оксикислота, присоединенная к коэнзиму А. В ходе третьей реакции происходит окисление этой спиртовой группы до кетогруппы, в качестве окислителя используется НАД + . Наконец, с образовавшимся β-кетоацил-коэнзимом А реагирует другая молекула коэнзима А. В результате отщепляется ацетил-коэнзим А, и ацил-КоА укорачивается на два углеродных атома. Теперь циклический процесс будет протекать по второму заходу, остаток жирной кислоты укоротится еще на один ацетил-КоА, и так до полного расщепления жирной кислоты. Из четырех реакций β-окисления только первая является необратимой, остальные – обратимы, их прохождение слева направо обеспечивается постоянным выводом конечных продуктов.

Суммарно β-окисление пальмитоил-коэнзима А протекает согласно уравнению:

Ацетил-КоА затем поступает в цикл Кребса. НАД∙Н и ФАД∙Н 2 окисляются в митохондриях, обеспечивая энергией синтез АТФ.

Катаболизм аминокислот протекает также через цикл Кребса. Различные аминокислоты поступает в цикл различными метаболическими путями, их рассмотрение слишком сложно для данного курса.

Цикл Кребса используется клеткой не только для энергетических нужд, но и для синтеза целого ряда необходимых ей веществ. Он является центральным метаболическим путем и в катаболических, и в анаболических процессах клетки.

Сам Ганс Кребс сперва теоретически предположил, что превращения ди- и трикарбоновых кислот протекают циклически, а затем проделал серию опытов, в которых показал взаимопревращения этих кислот и их способность стимулировать аэробный гликолиз. Однако решительные доказательства протекания этого метаболического пути именно так, а не иначе, были получены с помощью экспериментов с изотопной меткой.

Представьте себе, что вы в определенном промежуточном метаболите цикла Кребса заменили обычный природный изотоп на радиоактивный. Теперь это вещество как бы несет на себе радиоактивную метку, и это позволяет отследить его дальнейшую судьбу. Такое меченое соединение можно добавить к клеточному экстракту и через некоторое время посмотреть, во что оно превратится. Для этого можно отделить небольшие молекулы от макромолекул (например, осаждением последних) и разделить их смесь хроматографическим методом (см. урок 8). Затем останется только определить, в каких веществах содержится радиоактивность. Например, если вы добавите к экстракту радиоактивно меченую лимонную кислоту, то очень скоро метка обнаружится в цис-аконитовой и изолимонной кислоте, а еще через некоторое время – в α-кетоглютаровой. Если же добавить меченую α-кетоглютаровую кислоту, то метка раньше всего перейдет в сукцинил-коэнзим А и янтарную кислоту, потом – в фумаровую. Таким образом, добавляя различные радиоактивно меченые вещества и определяя, куда перешла радиоактивная метка, можно выяснить последовательность реакций на любом этапе метаболическом пути.

Определять радиоактивность можно различными путями. Самый простой способ – по засвечиванию фотографической эмульсии, ведь сама радиоактивность была открыта А. Беккерелем именно благодаря способности радиоактивного излучения засвечивать фотопластинку. Например, если мы разделили смесь веществ тонкослойной хроматографией и знаем, где расположено пятно того или иного вещества, то можно просто приложить к нашей хроматограмме фотопластинку. Тогда участок фотопластинки, соприкасавшийся с пятном, содержащим радиоактивность, окажется засвеченным. Остается только посмотреть, около пятен каких веществ фотоэмульсия засветилась, и сразу же можно сказать, что именно в эти вещества перешла радиоактивная метка.

Этот метод называется радиоавтографией . С его помощью можно изучать не только малые молекулы, но и крупные – например, добавив к живой клетке радиоактивно меченый уридин. Как мы уже говорили на 7-м уроке, уридиновые нуклеотиды входят в состав РНК, так что вскоре эта макромолекула будет радиоактивно помечена. Теперь можно отслеживать местонахождение и транспортировку РНК в клетке. Для этого нужно зафиксировать клетки, чтобы макромолекулы выпали в осадок и не уплыли при дальнейших процедурах, залить их фотоэмульсией и через некоторое время посмотреть в микроскоп, где появились засвеченные участки.

Радиоавтография позволяет непосредственно наблюдать за судьбой молекул в клетке. Однако у метода есть и недостаток – он дает лишь качественную характеристику наличия радиоактивной метки и не позволяет измерить ее количественно. Для точных количественных измерений используется другой способ. β-частицы, вылетающие из радиоактивных изотопов, вызывают свечение особых веществ – сцинтилляторов. Интенсивность этого свечения можно точно измерить с помощью специального прибора – сцинтилляционного счетчика. Точно измерив свечение, мы можем точно определить и количество радиоактивного изотопа. Однако использование сцинтилляционного счетчика позволяет измерить лишь общее количество радиоактивного изотопа в пробе. Если мы зальем раствором сцинтиллятора клеточную суспензию, то сможем определить суммарное количество радиоактивного соединения, но не его распределение по органеллам. Для этого нам придется выделять отдельные клеточные органеллы и измерять радиоактивность в них.

Обычно в биохимических исследованиях применяют такие изотопы как тритий 3 Н, углерод 14 С, фосфор 32 Р и серу 35 S.

Цикл Кребса также называется циклом трикарбоновых кислот , так как они образуются в нем в качестве промежуточных продуктов. Представляет собой ферментативный кольцевой конвейер, «работающий» в матриксе митохондрий.

Результатом цикла Кребса является синтез небольшого количества АТФ и образование НАД · H 2 , который далее направляется на следующий этап – дыхательную цепь (окислительное фосфорилирование), расположенную на внутренней мембране митохондрий.

Образовавшаяся в результате пировиноградная кислота (пируват) поступает в митохондрии, где она в конечном итоге полностью окисляется, превращаясь в углекислый газ и воду. Сначала это происходит в цикле Кребса, затем при окислительном фосфорилировании.

До цикла Кребса пируват декарбоксилируется и дегидрируется. В результате декарбоксилирования отщепляется молекула CO 2 , дегидрирование - это отщепление атомов водорода. Они соединяются с НАД.

В результате из пировиноградной кислоты образуется уксусная, которая присоединяется к коферменту А. Получается ацетилкофермент А (ацетил-КоА) – CH 3 CO~S-КоА, содержащий высокоэнергетическую связь.

Превращение пирувата в ацетил-КоА обеспечивает большой ферментативный комплекс, состоящий из десятков полипептидов, связанным с переносчиками электронов.

Цикл Кребса начинается с гидролиза ацетил-КоА, при котором отщепляется ацетильная группа, содержащая два атома углерода. Далее ацетильная группа включается в цикл трикарбоновых кислот.

Ацетильная группа присоединяется к щавелевоуксусной кислоте, имеющей четыре атома углерода. В результате образуется лимонная кислота, включающая шесть атомов углерода. Энергию для этой реакции поставляет макроэргическая связь ацетил-КоА.

Далее следует цепь реакций, в которых связанная в цикле Кребса ацетильная группа дегидрируются с высвобождением четырех пар атомов водорода и декарбоксилируются с образованием двух молекул CO 2 . При этом для окисления используется кислород, отщепляемый от двух молекул воды, а не молекулярный . Процесс называется окислительн ым декарбоксилирование м . В конце цикла щавелевоуксусная кислота регенерируется.

Вернемся на этап лимонной кислоты. Ее окисление проходит за ряд ферментативных реакций, при которых образуются изолимонная, щавелевоянтарная и другие кислоты. В результате этих реакций, на разных стадиях цикла, восстанавливаются три молекулы НАД и одна ФАД, образуется ГТФ (гуанозинтрифосфат), содержащий макроэргическую фосфатную связь, энергия которой впоследствии используется для фосфорилирования АДФ. В результате образуется молекула АТФ.

Лимонная кислота теряет два атома углерода с образованием двух молекул CO 2 .

В результате ферментативных реакций лимонная кислота превращается в щавелевоуксусную, которая снова может соединиться с ацетил-КоА. Цикл повторяется.

В составе лимонной кислоты присоединившийся остаток ацетил-КоА сгорает с образованием углекислого газа, атомов водорода и электронов. Водород и электроны переносятся на НАД и ФАД, которые являются акцепторами для него.

Окисление одной молекулы ацетил-КоА дает одну молекулу АТФ, четыре атома водорода и две молекулы углекислого газа. То есть углекислый газ, выделяемый при аэробном дыхании, образуется на этапе цикла Кребса . При этом молекулярный кислород (O 2) здесь не используется, он необходим лишь на этапе окислительного фосфорилирования.

Атомы водорода присоединяются к НАД или ФАД, в таком виде далее попадают в дыхательную цепь.

Одна молекула глюкозы дает две молекулы пирувата и, следовательно, два ацетил-КоА. Таким образом на одну молекулу глюкозы приходится два оборота цикла трикарбоновых кислот. В общей сложности образуются две молекулы АТФ, четыре CO 2 , восемь атомов H.

Следует отметить, что не только глюкоза и образующийся из нее пируват поступают в цикл Кребса. В результате расщепления ферментом липазой жиров образуются жирные кислоты, окисление которых также приводит к образованию ацетил-КоА, восстановлению НАД, а также ФАД (флавинадениндинуклеотида).

Если клетка испытывает дефицит углеводов и жиров, то окислению могут подвергаться аминокислоты. При этом образуются ацетил-КоА и органические кислоты, которые далее участвуют в цикле Кребса.

Таким образом неважно, каким был первичный источник энергии. В любом случае образуется ацетил-КоА, представляющий собой универсальное для клетки соединение.